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長(zhǎng)時(shí)間保存會(huì)影響細(xì)胞胞質(zhì)量嗎？

長(zhǎng)期凍存再恢復(fù)后，會(huì)影響細(xì)胞活力嗎？

……

拋開儲(chǔ)存方式去談儲(chǔ)存年限就是“耍流氓”，而細(xì)胞凍存這一技術(shù)在全球科研領(lǐng)域，實(shí)際上已經(jīng)擁有相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間了。

從冷凍生物學(xué)理論分析，在-196℃深低溫條件下，細(xì)胞的活性可以長(zhǎng)期保存。關(guān)于細(xì)胞凍存技術(shù)，可以追溯至1776年。

• 1776年

  Spallanzani（1776）最早發(fā)表了冷“處理”對(duì)“細(xì)胞”生命活動(dòng)影響的報(bào)道，他用雪冷凍玻璃瓶中的馬精子10多分鐘之后，再將玻璃瓶放回室溫下，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)令人驚奇的現(xiàn)象，那些原本已經(jīng)不動(dòng)了的精子又“復(fù)活”了，就好象是剛從輸精管排出來的一樣，冷處理延長(zhǎng)至數(shù)十分鐘，情況依然如此。于是，他認(rèn)為冷不能殺死精子。大約100年以后，許多早期的學(xué)者重復(fù)了低溫處理對(duì)精子活動(dòng)的影響，同樣得出了相似的結(jié)論。到1900年前后，科學(xué)家基本上肯定了生物成分（如精子和一些生物化學(xué)物質(zhì)）能夠在零下溫度貯存的事實(shí)。參考出處：丁香園

• 十九世紀(jì)中后葉

  十九世紀(jì)中后葉，許多早期的工作者(Prevost,1840;de Quatrefages,1853;Mantegazza,1866;Scheuk,1870)重復(fù)研究了低溫處理對(duì)精子活動(dòng)的影響,得出了和 Spallanzani相似的結(jié)論。即“冷不能殺死精子”。

• 1900年前后

  1900年前后，科學(xué)家基本上肯定了生物成份能夠在零下溫度儲(chǔ)存的事實(shí)。

  
  

• 20世紀(jì)50年代

  20世紀(jì)50年代，Luyet等多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)了電解質(zhì)濃度對(duì)儲(chǔ)存細(xì)胞的損傷作用，他們的基本結(jié)論是。電解質(zhì)濃度增大是造成儲(chǔ)存細(xì)胞損傷的主要原因。

• 60年代

  60年代，美國(guó)紐約血液中心Rowe實(shí)現(xiàn)了紅細(xì)胞的低溫保存。1980年，他將在液氮溫度下保存了12年的紅細(xì)胞復(fù)蘇后進(jìn)行檢查，沒有發(fā)現(xiàn)任何生化和功能上的變異，從而從實(shí)踐上證明了生物材料可以在低溫下長(zhǎng)期存活。

• 70年代

  70年代，Mazur等首先根據(jù)中國(guó)倉(cāng)鼠組織培養(yǎng)細(xì)胞的低溫保存實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，提出關(guān)于冷凍損傷的兩因素假說目，即冰晶損傷和溶液損傷假說。

• 80年代

  80年代以來，理學(xué)和工程學(xué)進(jìn)入低溫保存研究領(lǐng)域，低溫工程理論及實(shí)用設(shè)計(jì)原理的不斷更新及應(yīng)用，低溫生物學(xué)的研究快速發(fā)展。

• 20世紀(jì)

  20世紀(jì)以來，人類的科學(xué)研究進(jìn)入細(xì)胞水平階段，開始對(duì)生物和作為食品原料的生物材料進(jìn)行低溫保存處理。到了20世紀(jì)末，隨著科學(xué)方法的不斷進(jìn)步以及冷凍方法的不斷完善，低溫保存技術(shù)廣泛地應(yīng)用到了臨床上。

今天我們探討臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的儲(chǔ)存年限，也要先從臍帶血的儲(chǔ)存方式說起。臍帶血是被儲(chǔ)存在零下196℃的液氮罐中的，而在被放入液氮儲(chǔ)存前這份臍帶血?jiǎng)t會(huì)被特殊處理。

圖示：惟力維斯生命銀行

首先，為了防止造血干細(xì)胞在低溫環(huán)境中破損，會(huì)在臍帶血中加入冷凍保護(hù)劑。冷凍損傷主要發(fā)生在0℃到零下60℃，這段溫度區(qū)間被稱為“危險(xiǎn)溫度區(qū)”，而冷凍保護(hù)劑的使用可以保護(hù)細(xì)胞，盡可能免受冷凍損傷。

其次，儲(chǔ)存臍帶血時(shí)要使用程序降溫儀，嚴(yán)格按照預(yù)設(shè)程序冷凍后達(dá)到目標(biāo)溫度，低至一定的溫度后才可以轉(zhuǎn)入-196℃深低溫液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期凍存。

這種程序性降溫，使臍帶血造血干細(xì)胞的活性得到最大程度的保護(hù)，以免其出現(xiàn)我們常說的“凍死”。

圖示：程序降溫儀

凍存臍帶血造血干細(xì)胞是一項(xiàng)看似簡(jiǎn)單卻極具技術(shù)含量的系統(tǒng)工程，臍帶血放入液氮罐正式儲(chǔ)存前，為了防止造血干細(xì)胞在低溫環(huán)境中破損，需要對(duì)臍帶血加入冷凍保護(hù)劑，進(jìn)行降溫處理。

在降溫的過程中，要利用專業(yè)的計(jì)算機(jī)程序逐步緩慢降低溫度至-90℃后才可以轉(zhuǎn)入-196℃深低溫液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期凍存，保證干細(xì)胞的活性。

細(xì)胞制備

而且在凍存過程中，所有液氮罐需由真空管道相連，終端連接液氮存儲(chǔ)塔，對(duì)已經(jīng)儲(chǔ)存的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行24小時(shí)不間斷補(bǔ)充液氮。

為了保證臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞存儲(chǔ)環(huán)境的安全性，還需使用閉路監(jiān)控、紅外線報(bào)警、液位監(jiān)視、雙電路供電、氧含量實(shí)時(shí)監(jiān)控等24小時(shí)不間斷監(jiān)控系統(tǒng)嚴(yán)格監(jiān)控，至此，一份臍帶血才能長(zhǎng)期保存下來供臨床使用。

在液氮罐中“沉睡”20年之后，被凍存的臍帶血到底能不能“蘇醒”過來呢？我們看看真實(shí)的數(shù)據(jù)：

• 2012年

  2012年，北京市道培醫(yī)院救治一位49歲，體重達(dá)87公斤的白血病患者，臍血庫為其提供一份1998年已經(jīng)凍存14年的臍帶血， 復(fù)蘇后細(xì)胞活性達(dá)96%。

• 2014年

  2014年9月2日，劉女士(化名)在山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（原山東省千佛山醫(yī)院）成功接受單份臍帶血移植。該份臍帶血于2000年11月22日入庫，到移植時(shí)已儲(chǔ)存了長(zhǎng)達(dá)14年，在出庫復(fù)核時(shí)，細(xì)胞活性和有核細(xì)胞數(shù)完全符合移植條件。

• 2014年

  2014年12月，11歲湖南女孩曉穎在廣州南方醫(yī)院接受干細(xì)胞治療。而植入曉穎體內(nèi)的這份臍血，是在2000年在廣東省婦幼保健院采集的，已經(jīng)儲(chǔ)存了15年，移植前復(fù)蘇活性檢測(cè)高達(dá)94.2%。

• 2017年

  2017年一份采集于1998年5月，凍存18年11個(gè)月的臍帶血，復(fù)蘇后細(xì)胞活性為97.16%。

• 2018年

  2018年，一份1998年6月采集的臍帶血，凍存了20年零4個(gè)月，復(fù)蘇后活性為99.75%！

• 2020年

  2020年4月23日，北京市臍血庫抽檢一份凍存于1998年7月19日的臍帶血，復(fù)蘇后造血干細(xì)胞活性高達(dá)98.98%。該份臍帶血的凍存有效期為21年零9個(gè)月，刷新了北京市臍血庫臍帶血凍存有效期紀(jì)錄。

從這些數(shù)據(jù)我們可以看到即便是長(zhǎng)期凍存的臍帶血，復(fù)蘇之后，活性仍然很高，依然能夠很好地適用于臨床。目前也已有很多實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)成功低溫保存的細(xì)胞在-196℃的溫度中保存數(shù)十年，復(fù)溫后檢查，未發(fā)現(xiàn)任何生化和功能化的變異。

數(shù)據(jù)來源：《山東省臍血庫》

21世紀(jì)，將是細(xì)胞治療的時(shí)代。

這項(xiàng)顛覆性發(fā)展，儼然催生了醫(yī)學(xué)前沿技術(shù)的變革，干細(xì)胞為臨床疑難疾病治療提供了新手段，免疫細(xì)胞作為人體的”守衛(wèi)軍“被應(yīng)用到疾病治療、抗衰老、抗腫瘤中，作為醫(yī)學(xué)前沿技術(shù)，它們?cè)趪?guó)際上也備受“寵溺”，正在引領(lǐng)一場(chǎng)醫(yī)學(xué)革命。